محصولات
کیت تشخیص SARS-Cov-2-RT-PCR Lifecosm برای 2019-nCoV
استفاده مورد انتظار
این کیت برای تشخیص کیفی کروناویروس جدید (2019-nCoV) با استفاده از سواب گلو، سواب نازوفارنکس، مایع لاواژ برونکوآلوئولار، خلط استفاده می‌شود. شواهدی برای تشخیص و درمان بالینی. تجزیه و تحلیل جامع این وضعیت در ترکیب با تظاهرات بالینی بیمار و سایر آزمایش‌های آزمایشگاهی توصیه می‌شود.
اصل بازرسی
این کیت مبتنی بر فناوری RT-PCR یک مرحله ای است.در واقع، ژن‌های ORF1ab و N کروناویروس جدید ۲۰۱۹ (2019-nCoV) به عنوان مناطق هدف تقویت انتخاب شدند.پرایمرهای خاص و پروب‌های فلورسنت (کاوشگرهای ژن N با FAM و پروب‌های ORF1ab با HEX نشاندار شده‌اند) برای شناسایی RNA ویروس کرونا نوع جدید 2019 در نمونه‌ها طراحی شده‌اند.این کیت همچنین شامل یک سیستم تشخیص کنترل داخلی درون زا (کاوشگر ژن کنترل داخلی با برچسب CY5) برای نظارت بر فرآیند جمع آوری نمونه، RNA و تقویت PCR است و در نتیجه نتایج منفی کاذب را کاهش می دهد.
اجزای اصلی
| اجزاء | جلد(48 تن / کیت) |
| محلول واکنش RT-PCR | 96 میکرولیتر |
| پرایمر nCOV TaqMan probemixture (ORF1ab، N Gene، RnaseP Gene) | 864 میکرولیتر |
| کنترل منفی | 1500 میکرولیتر |
| کنترل مثبت nCOV ( ژن ORF1ab N) | 1500 میکرولیتر |
معرف های خود: معرف های استخراج یا خالص سازی RNA.کنترل منفی/مثبت: کنترل مثبت RNA حاوی قطعه هدف است، در حالی که کنترل منفی آب بدون اسید نوکلئیک است.در طول استفاده، آنها باید در استخراج شرکت کنند و باید عفونی در نظر گرفته شوند.آنها باید مطابق با مقررات مربوطه اداره و دفع شوند.
ژن مرجع داخلی ژن RnaseP انسانی است.
شرایط نگهداری و تاریخ انقضا
-20±5 ℃، از انجماد و ذوب مکرر بیش از 5 بار اجتناب کنید، اعتبار به مدت 6 ماه.
ابزار قابل اجرا
با FAM / HEX / CY5 و سایر ابزارهای فلورسنت PCR چند کاناله.
الزامات نمونه
1. انواع نمونه قابل استفاده: سواب گلو، سواب نازوفارنکس، مایع لاواژ برونش آلوئولار، خلط.
2. جمع آوری نمونه (تکنیک آسپتیک)
سواب حلقی: لوزه ها و دیواره خلفی حلق را با دو سواب به طور همزمان پاک کنید، سپس سر سواب را در یک لوله آزمایش حاوی محلول نمونه برداری فرو ببرید.
خلط: پس از سرفه عمیق بیمار، خلط سرفه شده را در یک لوله آزمایش درپوش پیچ حاوی محلول نمونه برداری جمع آوری کنید.مایع لاواژ برونکوآلوئولار: نمونه برداری توسط متخصصان پزشکی.3. ذخیره سازی و حمل و نقل نمونه ها
نمونه های جداسازی ویروس و آزمایش RNA باید در اسرع وقت مورد آزمایش قرار گیرند.نمونه هایی که می توانند در عرض 24 ساعت شناسایی شوند را می توان در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری کرد.آنهایی که در عرض 24 قابل شناسایی نیستند
ساعت ها باید در دمای -70 درجه سانتیگراد یا کمتر ذخیره شوند (اگر شرایط ذخیره سازی 70- درجه سانتیگراد وجود ندارد، آنها باید ذخیره شوند.
به طور موقت در یخچال -20 درجه سانتیگراد ذخیره می شود.نمونه ها باید از انجماد و ذوب مکرر در طول حمل و نقل خودداری کنند.نمونه ها باید در اسرع وقت پس از جمع آوری به آزمایشگاه ارسال شوند.در صورت نیاز به حمل و نقل نمونه ها در فواصل طولانی، نگهداری یخ خشک توصیه می شود.
روش های آزمون
1 پردازش نمونه و استخراج RNA (منطقه پردازش نمونه)
توصیه می شود 200 میکرولیتر نمونه مایع برای استخراج RNA بگیرید.برای مراحل استخراج مرتبط، به دستورالعمل های کیت های استخراج RNA تجاری مراجعه کنید.هم منفی و هم منفی
کنترل های موجود در این کیت در استخراج نقش داشتند.
2 آماده سازی معرف PCR (منطقه آماده سازی معرف)
2.1 تمام اجزا را از کیت خارج کرده و ذوب کرده و در دمای اتاق مخلوط کنید.قبل از استفاده، چند ثانیه با سرعت 8000 دور در دقیقه سانتریفیوژ کنید.مقدار مورد نیاز معرف ها را محاسبه کنید و سیستم واکنش مطابق جدول زیر آماده می شود:
| اجزاء | وعده N (سیستم 25µl) |
| پرایمر nCOV Probemixture TaqMan | 18 میکرولیتر × N |
| محلول واکنش RT-PCR | 2 میکرولیتر × N |
| *N = تعداد نمونه های آزمایش شده + 1 (کنترل منفی) + 1 (nCOVکنترل مثبت) | |
2.2 پس از مخلوط کردن کامل اجزاء، برای مدت کوتاهی سانتریفیوژ کنید تا تمام مایع روی دیواره لوله به پایین لوله بریزد و سپس سیستم تقویت 20 میکرولیتری را به لوله PCR تقسیم کنید.
3 نمونه برداری (منطقه آماده سازی نمونه)
5 میکرولیتر از کنترل های منفی و مثبت را پس از استخراج اضافه کنید.RNA نمونه مورد آزمایش به لوله واکنش PCR اضافه می شود.
لوله را محکم ببندید و قبل از انتقال آن به ناحیه تشخیص تقویت، چند ثانیه با سرعت 8000 دور در دقیقه سانتریفیوژ کنید.
4 تقویت PCR (منطقه تشخیص تقویت شده)
4.1 لوله واکنش را در سلول نمونه ابزار قرار داده و پارامترها را به صورت زیر تنظیم کنید:
| صحنه | چرخه عدد | درجه حرارت(درجه سانتیگراد) | زمان | مجموعهسایت |
| معکوسرونویسی | 1 | 42 | 10 دقیقه | - |
| پیش دناتوراسیونn | 1 | 95 | 1 دقیقه | - |
| چرخه | 45 | 95 | 15 ثانیه | - |
| 60 | دهه 30 | جمع آوری داده ها |
انتخاب کانال تشخیص ابزار: کانال FAM, HEX, CY5 را برای سیگنال فلورسانس انتخاب کنید.برای مرجع فلورسنت NONE، لطفاً ROX را انتخاب نکنید.
5 تجزیه و تحلیل نتایج (لطفاً به دستورالعمل های تجربی هر ابزار برای تنظیم مراجعه کنید)
پس از واکنش، نتایج را ذخیره کنید.پس از تجزیه و تحلیل، مقدار شروع، مقدار پایان و مقدار آستانه خط پایه را مطابق تصویر تنظیم کنید (کاربر می تواند با توجه به وضعیت واقعی تنظیم کند، مقدار شروع را می توان روی 3 ~ 15 تنظیم کرد، مقدار پایانی را می توان روی 5~20، تنظیم) در نمودار لگاریتمی در آستانه پنجره، خط آستانه در فاز لگاریتمی است و منحنی تقویت کنترل منفی یک خط مستقیم یا زیر خط آستانه است.
6 کنترل کیفی (یک کنترل رویه ای در آزمایش گنجانده شده است) کنترل منفی: بدون منحنی تقویت واضح برای کانال های تشخیص FAM، HEX، CY5
کنترل مثبت COV: منحنی تقویت آشکار کانال های تشخیص FAM و HEX، مقدار Ct≤32، اما منحنی تقویت کانال CY5 وجود ندارد.
الزامات فوق باید به طور همزمان در همان آزمایش برآورده شوند.در غیر این صورت، آزمایش نامعتبر است و باید تکرار شود.
7 تعیین نتایج
7.1 اگر هیچ منحنی تقویت یا مقدار Ct> 40 در کانال های FAM و HEX نمونه آزمایشی وجود نداشته باشد و منحنی تقویت در کانال CY5 وجود داشته باشد، می توان قضاوت کرد که ویروس کرونای جدید 2019 (2019-nCoV) وجود ندارد. RNA در نمونه؛
.2 اگر نمونه آزمایشی دارای منحنی های تقویت آشکار در کانال های FAM و HEX باشد و مقدار Ct ≤40 باشد، می توان قضاوت کرد که نمونه برای کروناویروس جدید 2019 (2019-nCoV) مثبت است.
7.3 اگر نمونه آزمایشی فقط در یک کانال FAM یا HEX منحنی تقویت واضح داشته باشد و مقدار Ct ≤40 باشد و در کانال دیگر منحنی تقویت وجود نداشته باشد، نتایج نیاز به آزمایش مجدد دارند.اگر نتایج بازآزمایی با هم سازگار باشد، می‌توان نمونه را مثبت ارزیابی کرد
کرونا 2019 (2019-nCoV).اگر نتیجه آزمایش مجدد منفی باشد، می توان قضاوت کرد که نمونه برای کروناویروس جدید 2019 (2019-nCoV) منفی است.
ارزش قضاوت مثبت
برای تعیین مقدار مرجع CT کیت از روش منحنی ROC استفاده می شود و مقدار مرجع کنترل داخلی 40 می باشد.
تفسیر نتایج آزمون
1. هر آزمایش باید برای کنترل منفی و مثبت آزمایش شود.نتایج آزمایش تنها زمانی قابل تعیین است که کنترل ها الزامات کنترل کیفیت را برآورده کنند
2. هنگامی که کانال های تشخیص FAM و HEX مثبت هستند، نتیجه کانال CY5 (کانال کنترل داخلی) ممکن است به دلیل رقابت سیستم منفی باشد.
3. هنگامی که نتیجه کنترل داخلی منفی است، اگر کانال های تشخیص FAM و HEX لوله آزمایش نیز منفی باشد، به این معنی است که سیستم غیرفعال است یا عملکرد اشتباه است، آزمایش نامعتبر است.بنابراین، نمونه ها نیاز به آزمایش مجدد دارند.
