محصولات
کیت تشخیص SARS-Cov-2-RT-PCR شرکت Lifecosm برای ویروس کرونای جدید (2019-nCoV)
میزان مصرف مورد انتظار
این کیت برای تشخیص کیفی ویروس کرونای جدید (2019-nCoV) با استفاده از سواب گلو، سواب نازوفارنکس، مایع لاواژ برونکوآلوئولار و خلط استفاده می‌شود. نتیجه تشخیص این محصول فقط برای مرجع بالینی است و نباید به عنوان تنها مدرک برای تشخیص و درمان بالینی استفاده شود. تجزیه و تحلیل جامع از وضعیت در ترکیب با تظاهرات بالینی بیمار و سایر آزمایش‌های آزمایشگاهی توصیه می‌شود.
اصل بازرسی
این کیت مبتنی بر فناوری RT-PCR یک مرحله‌ای است. در واقع، ژن‌های ORF1ab و N ویروس کرونای جدید 2019 (2019-nCoV) به عنوان مناطق هدف تکثیر انتخاب شدند. پرایمرهای اختصاصی و پروب‌های فلورسنت (پروب‌های ژن N با FAM و پروب‌های ORF1ab با HEX نشاندار شده‌اند) برای شناسایی RNA ویروس کرونای جدید 2019 در نمونه‌ها طراحی شده‌اند. این کیت همچنین شامل یک سیستم تشخیص کنترل داخلی درون‌زا (پروب ژن کنترل داخلی نشاندار شده با CY5) برای نظارت بر فرآیند جمع‌آوری نمونه، تکثیر RNA و PCR است و در نتیجه نتایج منفی کاذب را کاهش می‌دهد.
اجزای اصلی
| قطعات | حجم(۴۸T/کیت) |
| محلول واکنش RT-PCR | ۹۶ میکرولیتر |
| پرایمر nCOV TaqMan probemixture (ORF1ab، N Gene، RnaseP Gene) | ۸۶۴ میکرولیتر |
| کنترل منفی | ۱۵۰۰ میکرولیتر |
| کنترل مثبت nCOV ( ژن ORF1ab N) | ۱۵۰۰ میکرولیتر |
معرف‌های شخصی: معرف‌های استخراج یا خالص‌سازی RNA. کنترل منفی/مثبت: کنترل مثبت، RNA حاوی قطعه هدف است، در حالی که کنترل منفی، آب بدون اسید نوکلئیک است. در حین استفاده، آنها باید در استخراج شرکت کنند و باید عفونی در نظر گرفته شوند. آنها باید مطابق با مقررات مربوطه حمل و دفع شوند.
ژن مرجع داخلی، ژن RnaseP انسانی است.
شرایط نگهداری و تاریخ انقضا
-20±5℃، از انجماد و ذوب مکرر بیش از 5 بار خودداری کنید، به مدت 6 ماه معتبر است.
ابزار قابل اجرا
با FAM / HEX / CY5 و سایر ابزارهای PCR فلورسنت چند کاناله.
الزامات نمونه
۱. انواع نمونه قابل اجرا: سواب گلو، سواب نازوفارنکس، مایع لاواژ برونکوآلوئولار، خلط.
۲. جمع‌آوری نمونه (روش آسپتیک)
سواب حلقی: لوزه‌ها و دیواره خلفی حلق را همزمان با دو سواب پاک کنید، سپس سر سواب را در لوله آزمایش حاوی محلول نمونه‌برداری فرو کنید.
خلط: پس از اینکه بیمار سرفه عمیقی داشت، خلط سرفه شده را در یک لوله آزمایش درپیچ‌دار حاوی محلول نمونه‌برداری جمع‌آوری کنید؛ مایع لاواژ برونکوآلوئولار: نمونه‌برداری توسط متخصصان پزشکی. ۳. نگهداری و حمل نمونه‌ها
نمونه‌های مورد نیاز برای جداسازی ویروس و آزمایش RNA باید در اسرع وقت آزمایش شوند. نمونه‌هایی که می‌توانند ظرف ۲۴ ساعت تشخیص داده شوند، می‌توانند در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شوند؛ نمونه‌هایی که نمی‌توانند ظرف ۲۴ ساعت تشخیص داده شوند.
ساعت‌ها باید در دمای -70 درجه سانتیگراد یا کمتر نگهداری شوند (اگر شرایط نگهداری -70 درجه سانتیگراد وجود ندارد، باید ...
به طور موقت در یخچال -20 درجه سانتیگراد نگهداری شود). نمونه‌ها باید از انجماد و ذوب مکرر در حین حمل و نقل خودداری کنند. نمونه‌ها باید در اسرع وقت پس از جمع‌آوری به آزمایشگاه ارسال شوند. در صورت نیاز به انتقال نمونه‌ها به مسافت‌های طولانی، نگهداری در یخ خشک توصیه می‌شود.
روش‌های آزمون
۱- پردازش نمونه و استخراج RNA (بخش پردازش نمونه)
توصیه می‌شود برای استخراج RNA، 200 میکرولیتر نمونه مایع برداشته شود. برای مراحل استخراج مرتبط، به دستورالعمل‌های کیت‌های استخراج RNA تجاری مراجعه کنید. هم منفی و هم منفی
کنترل‌های موجود در این کیت در استخراج دخیل بودند.
۲ آماده‌سازی معرف PCR (محل آماده‌سازی معرف)
۲.۱ تمام اجزا را از کیت خارج کرده و در دمای اتاق یخ‌زدایی و مخلوط کنید. قبل از استفاده، چند ثانیه با سرعت ۸۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ کنید؛ مقدار مورد نیاز واکنشگرها را محاسبه کنید و سیستم واکنش مطابق جدول زیر آماده شود:
| قطعات | وعده N (سیستم ۲۵ میکرولیتری) |
| پرایمر nCOV Probemixture TaqMan | ۱۸ میکرولیتر × نیتروژن |
| محلول واکنش RT-PCR | ۲ میکرولیتر × نیتروژن |
| *N = تعداد نمونه‌های آزمایش‌شده + ۱ (کنترل منفی) + ۱ (nCOV)کنترل مثبت) | |
۲.۲ پس از مخلوط کردن کامل اجزا، برای مدت کوتاهی سانتریفیوژ کنید تا تمام مایع روی دیواره لوله به ته لوله بریزد و سپس ۲۰ میکرولیتر از سیستم تکثیر را به لوله PCR اضافه کنید.
۳ نمونه‌برداری (محل آماده‌سازی نمونه)
پس از استخراج، 5 میکرولیتر از کنترل‌های منفی و مثبت اضافه کنید. RNA نمونه مورد آزمایش به لوله واکنش PCR اضافه می‌شود.
لوله را محکم ببندید و قبل از انتقال آن به ناحیه تشخیص تکثیر، به مدت چند ثانیه با سرعت 8000 دور در دقیقه سانتریفیوژ کنید.
۴ تکثیر PCR (ناحیه تشخیص تکثیر شده)
۴.۱ لوله واکنش را در محفظه نمونه دستگاه قرار دهید و پارامترها را به صورت زیر تنظیم کنید:
| مرحله | چرخه شماره | دما(درجه سانتیگراد) | زمان | مجموعهسایت |
| معکوسرونویسی | 1 | 42 | ۱۰ دقیقه | - |
| پیش دناتوراسیونn | 1 | 95 | ۱ دقیقه | - |
| چرخه | 45 | 95 | ۱۵ ثانیه | - |
| 60 | دهه 30 میلادی | جمع‌آوری داده‌ها |
انتخاب کانال تشخیص ابزار: کانال FAM، HEX، CY5 را برای سیگنال فلورسانس انتخاب کنید. برای مرجع فلورسنت NONE، لطفاً ROX را انتخاب نکنید.
۵ تحلیل نتایج (لطفاً برای تنظیمات به دستورالعمل‌های تجربی هر دستگاه مراجعه کنید)
پس از واکنش، نتایج را ذخیره کنید. پس از تجزیه و تحلیل، مقدار شروع، مقدار پایان و مقدار آستانه خط پایه را مطابق تصویر تنظیم کنید (کاربر می‌تواند با توجه به وضعیت واقعی تنظیم کند، مقدار شروع را می‌توان روی ۳ تا ۱۵ تنظیم کرد، مقدار پایان را می‌توان روی ۵ تا ۲۰ تنظیم کرد، تنظیم) در نمودار لگاریتمی در آستانه پنجره، خط آستانه در فاز لگاریتمی است و منحنی تقویت کنترل منفی یک خط مستقیم یا زیر خط آستانه است.
۶ کنترل کیفی (یک کنترل رویه‌ای در آزمایش گنجانده شده است) کنترل منفی: هیچ منحنی تقویت واضحی برای کانال‌های تشخیص FAM، HEX، CY5 وجود ندارد
کنترل مثبت COV: منحنی تقویت کانال‌های تشخیص FAM و HEX واضح است، مقدار Ct≤32، اما منحنی تقویت کانال CY5 وجود ندارد.
الزامات فوق باید همزمان در یک آزمایش رعایت شوند؛ در غیر این صورت، آزمایش نامعتبر است و نیاز به تکرار دارد.
۷ تعیین نتایج.
۷.۱ اگر در کانال‌های FAM و HEX نمونه آزمایش، منحنی تکثیر یا مقدار Ct > 40 وجود نداشته باشد و در کانال CY5 منحنی تکثیر وجود داشته باشد، می‌توان قضاوت کرد که RNA ویروس کرونای جدید ۲۰۱۹ (2019-nCoV) در نمونه وجود ندارد؛
۲. اگر نمونه آزمایش دارای منحنی‌های تقویت واضح در کانال‌های FAM و HEX باشد و مقدار Ct ≤۴۰ باشد، می‌توان قضاوت کرد که نمونه برای کروناویروس جدید ۲۰۱۹ (2019-nCoV) مثبت است.
۷.۳ اگر نمونه آزمایش فقط در یک کانال FAM یا HEX منحنی تقویت واضحی داشته باشد و مقدار Ct ≤۴۰ باشد و در کانال دیگر منحنی تقویتی وجود نداشته باشد، نتایج باید دوباره آزمایش شوند. اگر نتایج آزمایش مجدد ثابت باشد، می‌توان نمونه را برای کانال جدید مثبت در نظر گرفت.
ویروس کرونا ۲۰۱۹ (۲۰۱۹-nCoV). اگر نتیجه آزمایش مجدد منفی باشد، می‌توان قضاوت کرد که نمونه برای ویروس کرونای جدید ۲۰۱۹ (۲۰۱۹-nCoV) منفی است.
ارزش قضاوت مثبت
از روش منحنی ROC برای تعیین مقدار مرجع CT کیت استفاده می‌شود و مقدار مرجع کنترل داخلی 40 است.
تفسیر نتایج آزمایش
۱. هر آزمایش باید از نظر کنترل‌های منفی و مثبت بررسی شود. نتایج آزمایش فقط زمانی قابل تعیین است که کنترل‌ها الزامات کنترل کیفیت را برآورده کنند.
۲. هنگامی که کانال‌های تشخیص FAM و HEX مثبت هستند، نتیجه کانال CY5 (کانال کنترل داخلی) ممکن است به دلیل رقابت سیستم منفی باشد.
۳. وقتی نتیجه کنترل داخلی منفی باشد، اگر کانال‌های تشخیص FAM و HEX لوله آزمایش نیز منفی باشند، به این معنی است که سیستم غیرفعال شده یا عملیات اشتباه است، و آزمایش نامعتبر است. بنابراین، نمونه‌ها باید دوباره آزمایش شوند.
